BIOLOGIE — CRISPR : une révolution génétique à portée de main

Simon Mathien — Programme de doctorat en biologie moléculaire

BIOLOGIE — CRISPR : une révolution génétique à portée de main

Derrière l’acronyme CRISPR se cache une révolution technologique provenant des bactéries et qui rend possible, comme jamais auparavant, la manipulation génétique. L’efficacité et la simplicité du CRISPR changent radicalement la façon de penser dans le domaine du génie génétique et de la recherche biomédicale, à tel point que la revue Science l’a décrété, à la fin de 2015, « découverte de l’année ». Les laboratoires du monde entier utilisent maintenant cette technologie et en élaborent de nouvelles applications. Toutefois, au-delà des pas de géant qu’il permet pour la recherche en biologie et qu’il promet dans le domaine médical, le potentiel inédit du CRISPR pose des questions éthiques, notamment quant à la manipulation du génome de l’espèce humaine.

Un peu moins de vingt ans après la très médiatisée naissance de la brebis clonée Dolly, Ningning et Mingming, deux jumelles macaques, voyaient le jour tout au début de 2014 dans un laboratoire de l’Université de Nanjing en Chine [1]. Leur particularité ? Elles sont les premiers primates génétiquement modifiés grâce au système CRISPR. Avec cette avancée, les chercheurs chinois prouvaient que le CRISPR est efficace chez l’un des plus proches parents de l’humain, renforçant encore un peu plus l’espoir de son utilisation pour la thérapie génique. Depuis, les applications du CRISPR se sont multipliées, allant de la conception de plantes résistantes à des champignons parasitaires à la correction d’une maladie génétique du foie chez des souris [2]. Pour la médecine, son potentiel paraît sans limites. En modifiant les gènes ou leur expression directement chez le patient, les médecins espèrent pouvoir guérir des maladies tels le cancer et le diabète ainsi que les maladies génétiques comme les dystrophies musculaires et la fibrose kystique. Néanmoins, cette nouvelle facilité à manipuler le génome des espèces vivantes génère de nouvelles inquiétudes, puisqu’elle augmente les possibilités de modifier le patrimoine génétique de l’humain. Cette question éthique, liée à l’eugénisme *, fait débat au sein de la communauté scientifique.

Un bistouri génétique issu des bactéries

L’histoire du CRISPR commence en 1987, au Japon. Atsuo Nakata, chercheur à l’Université d’Osaka, découvre des séquences répétées d’ADN dans le génome de la bactérie Escherichia coli [3]. Ces séquences seront baptisées « CRISPR » pour « Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats », ou « courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées ». On ne le sait pas encore à cette époque, mais elles sont en fait des séquences d’ADN de virus que les bactéries ont intégrées à leur propre génome. La découverte passera presque inaperçue pendant vingt ans, jusqu’à ce qu’en 2007, une équipe de chercheurs travaillant pour une entreprise laitière danoise, en collaboration avec l’équipe de Sylvain Moineau (professeur de biochimie et de microbiologie à l’Université Laval), observe un phénomène étonnant : certaines des bactéries utilisées pour la production de yogourt sont protégées contre les bactériophages, un type de virus particulier qui s’attaque aux bactéries. Ces scientifiques remarquent que ce sont les séquences CRIPSR qui confèrent cette protection [4]. Dès lors germe l’hypothèse qu’il s’agit d’une sorte de système immunitaire primitif développé par les bactéries pour se protéger. Agissant un peu comme un vaccin, ces séquences répétées provenant de virus sont gardées en mémoire dans le génome de la bactérie après une première infection pour l’aider à combattre d’éventuelles invasions. Toutefois, c’est finalement en 2012 qu’intervient la découverte qui fera du CRISPR la révolution qu’on connaît aujourd’hui. Deux chercheuses, Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna, l’une française et travaillant à l’Université d’Umeå en Suède, l’autre américaine et chercheuse à l’Université de Californie à Berkeley, mettent en lumière le fonctionnement et les applications du système CRISPR pour l’édition génétique [5].

À l’origine du CRISPR se trouvent donc ces séquences répétées d’ADN viral présentes dans le génome des bactéries. Comme pour un gène classique, ces fragments d’ADN seront transcrits en une molécule composée d’ARN *. Dans le cas d’un gène, cet ARN sert d’intermédiaire pour produire une protéine à partir de l’information contenue dans l’ADN. Dans le cas des séquences CRISPR, l’ARN est utilisé comme une sonde qui sert à reconnaître les virus. Ces sondes pourraient être comparées aux anticorps de notre système immunitaire : elles patrouillent dans la cellule à la recherche de leur ADN complémentaire, c’est-à-dire l’ADN viral. Si une infection survient, le virus sera donc reconnu et pourra ensuite être éliminé. En effet, l’autre composante du CRISPR, une enzyme coupeuse d’ADN nommée Cas9, entre alors en action : l’ADN du virus sera dégradé à l’endroit reconnu par la sonde et il ne pourra plus se multiplier, ce qui contrecarerra l’infection.

Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna voient dans ce système de défense antiviral un outil permettant de manipuler l’information génétique avec une facilité déconcertante. L’idée est simple : détourner le système CRISPR pour qu’il s’attaque non plus à l’ADN d’un virus, mais à celui d’une cellule hôte, ce qui permettra d’éditer son génome. Le scientifique doit simplement créer des sondes d’ARN artificielles qui reconnaissent le gène d’intérêt et les introduire, accompagnées de l’enzyme Cas9, dans la cellule. Le système CRISPR agissant comme un véritable bistouri génétique, la Cas9 sera dirigée vers le gène ciblé et le coupera à l’endroit précis indiqué par la sonde.

Pour la recherche biomédicale, le potentiel du CRISPR est considérable. En utilisant des cellules embryonnaires d’animaux de laboratoire, un animal dont toutes les cellules porteront la modification génétique peut être créé. Ces modèles permettent, par exemple, de désactiver un gène pour étudier sa fonction, de réprimer l’expression d’un gène associé à l’apparition du cancer, ou même, en utilisant le potentiel de réparation de l’ADN déjà présent dans les cellules, de modifier la séquence d’un gène, c’est-à-dire d’y introduire une nouvelle mutation ou d’en corriger une existante, dans le cas d’une maladie génétique par exemple. La liste de ces applications ne cesse de croître.

Une efficacité qui change la donne

La capacité de modifier le génome à l’aide d’outils moléculaires n’est pas une découverte en soi. Depuis 1996, des enzymes issues de bactéries, nommées « nucléases à doigts de zinc », sont utilisées pour couper les gènes à des endroits précis [6]. En 2009, une autre classe d’enzymes, nommée « TALEN », avait été identifiée [7]. Ces deux technologies fonctionnent sur un principe similaire à celui du CRISPR. En revanche, contrairement à ce dernier, leur domaine de reconnaissance, les « sondes », n’est pas constitué d’ARN, mais d’un fragment de protéine, beaucoup plus complexe à produire en laboratoire. Le développement de ces technologies est donc un processus fastidieux et onéreux : la production de ces protéines coûte au minimum plusieurs milliers de dollars par gène et demande dans la grande majorité des cas la participation de sociétés de biotechnologie spécialisées. De plus, du début de la mise au point à l’obtention d’une cellule ou d’un animal au génome modifié, plusieurs mois se seront écoulés. Le CRISPR permet quant à lui, en moins de deux semaines et pour une centaine de dollars, d’obtenir le même résultat grâce à des techniques de routine en laboratoire universitaire.

La révolution du CRISPR se situe donc dans son efficacité et son accessibilité sans précédent, qui changent en profondeur le domaine du génie génétique. Preuve du succès de la méthode, une simple recherche sur les banques de données de références en ligne indique que plus d’un millier d’articles publiés dans des revues scientifiques en 2015 citent la technologie du CRISPR [8].

Un potentiel médical inédit

L’une des conséquences de cette démocratisation est l’évolution rapide de cette technologie et de ses applications, en particulier dans le domaine médical. Des chercheurs l’utilisent par exemple pour développer des outils servant à mettre au point de nouvelles thérapies. C’est le cas des modèles animaux qui, en mimant les mutations apparaissant chez l’humain, reproduisent les effets de nos maladies. Ces modèles étaient, jusqu’au CRISPR, complexes à développer. Dorénavant, de nombreux laboratoires peuvent les générer, ce qui augmente d’autant le potentiel de découvertes. Des projets inimaginables il y a quelques années fleurissent aujourd’hui : des moustiques génétiquement conçus pour enrayer la transmission de la malaria ont été développés en laboratoire [9] ; des compagnies biotechnologiques ont été créées pour mettre au point, à partir du CRISPR, des traitements efficaces contre les bactéries résistantes aux antibiotiques, retournant ainsi le CRISPR contre l’organisme dont il provient.

Au-delà de ces applications encore en développement, le CRISPR relance l’intérêt pour un domaine de la médecine qui avait suscité beaucoup d’espoir au début des années 2000 : la thérapie génique. Cette approche repose sur la manipulation directe du génome des cellules humaines à des fins thérapeutiques. En effet, le point commun d’un grand nombre de maladies est qu’elles sont dues à des anomalies génétiques. C’est par exemple le cas des cancers, mais aussi du diabète insulino-dépendant (de type 1), de certaines anémies et de la plupart des maladies dégénératives. Dans ces différentes pathologies, des mutations sont présentes dans l’ADN, c’est-à-dire que la séquence d’un gène comporte une erreur d’écriture. En utilisant le CRISPR, ces anomalies du génome pourraient être réparées et les causes de ces maladies, supprimées. Ce serait, par exemple, le cas pour les cancers du sein causés par une version mutée des gènes BRCA, transmise de manière héréditaire. À la suite d’un dépistage génétique positif, les patientes n’ont à l’heure actuelle que peu d’options, certaines se tournant même vers une mastectomie préventive. Qui plus est, les probabilités de transmettre cette mutation à leur descendance sont élevées, ce qui représente pour les porteurs de la mutation un stress supplémentaire lors de la procréation, pouvant impliquer des procédures risquées comme celle d’entreprendre des tests génétiques prénataux [10]. En somme, l’utilisation d’une thérapie basée sur le CRISPR pourrait permettre de réparer directement les gènes défectueux et donc d’éliminer le risque accru de cancer et de prédisposition héréditaire.

Des questions éthiques sont soulevées

Toutefois, malgré l’optimisme affiché par de nombreux scientifiques au sujet du CRISPR, certaines limitations persistent. L’une d’entre elles est due à notre connaissance encore partielle du mécanisme du CRISPR. Comme toute technologie d’édition du génome, le CRISPR n’est pas parfait. Dans certains cas, il est possible que les sondes reconnaissent une partie du génome pour laquelle elles ne sont pas conçues : il s’agit d’un effet « hors cible ». Si cela représente seulement un inconvénient à considérer pour les expériences de laboratoire, pour la thérapie génique, par contre, les préjudices sont potentiellement considérables. La seconde limitation tient au fait que la cellule est un milieu complexe dans un état d’équilibre subtil où les gènes sont des composantes en interaction constante. L’état actuel de nos connaissances ne permet pas de prévoir précisément toutes les conséquences des modifications d’une seule de ces composantes. Éditer la séquence d’un gène peut, indirectement et involontairement, modifier l’expression ou l’activité d’un autre gène. De même, la modification d’un même gène dans le cerveau et dans le cœur peut avoir des effets différents. Ainsi, puisque tous les effets de l’édition génétique ne sont encore ni connus ni maîtrisés, tenter de guérir une maladie grâce à cette technologie pourrait en faire apparaître une nouvelle.

Une autre conséquence potentielle des manipulations génétiques a trait à l’environnement. Les ingrédients du débat sont de même nature que ceux évoqués dans celui sur l’utilisation des organismes génétiquement modifiés (OGM) dans l’agriculture. Par exemple, les moustiques modifiés pour ne pas transmettre la malaria présentent un risque potentiel s’ils étaient relâchés dans la nature : ils pourraient disséminer leur patrimoine génétique à d’autres espèces de moustiques, ce qui provoquerait des effets à ce jour imprévisibles. Ils pourraient aussi réduire, voire éradiquer les populations locales de moustiques, menaçant ainsi l’équilibre de la chaîne alimentaire de leurs milieux de vie.

La principale cause de questionnements au sein de la communauté scientifique concerne toutefois le fait même de manipuler le génome humain. Cette éventualité est devenue réalité au printemps 2015, quand des chercheurs chinois rapportaient pour la première fois des expériences de manipulation génétique d’embryons humains réalisées à l’aide de la technologie du CRISPR [11]. Il devient alors techniquement envisageable à court terme de manipuler l’information génétique d’un individu, ce qui pose la question des limites qui doivent être imposées. En effet, s’il devient possible de modifier le génome d’un embryon aux stades précoces de son développement pour qu’il ne développe pas de maladies génétiques au mauvais pronostic, comme la fibrose kystique et la maladie de Huntington, rien n’empêche d’étendre ces manipulations à la myopie ou même aux taches de rousseur. Des garde-fous sont donc nécessaires, et la discussion à ce sujet est déjà amorcée. En juin 2015, Jennifer Doudna, l’une des pionnières du CRISPR, présentait devant le Sénat des États-Unis les conclusions d’une rencontre qu’elle a co-organisée avec d’autres experts du domaine [12]. Les points clés de son intervention recommandaient de continuer la recherche sur l’édition du génome afin de mieux en comprendre les risques et les bénéfices, tout en l’encadrant par des recommandations pour une utilisation éthiquement responsable. Finalement, la scientifique avait souligné l’importance d’éduquer le public quant aux avantages et aux inconvénients de ces nouvelles technologies. Pour elle, c’est là une condition essentielle à la tenue d’un véritable débat réunissant tous les acteurs de la société, nécessaire pour déterminer quels sont les usages acceptables de l’édition génétique.

Lexique :

Eugénisme : théorie visant à faire tendre l’évolution de l’espèce humaine vers un idéal déterminé, par l’entremise de modifications du patrimoine génétique.

ARN : acide ribonucléique, molécule qui agit comme un messager et transmet l’information génétique contenue dans l’ADN des gènes.

Références

[1] Niu, Y., Shen, B., Cui, Y., Chen, Y., Wang, J., Wang, L., … Sha, J. (2014). Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell, 156(4), 836-843. doi : 10.1016/j.cell.2014.01.027

[2] Wang, Y., Cheng, X., Shan, Q., Zhang, Y., Liu, J., Gao, C. et Qiu, J.-L. (2014). Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology, 32(9), 947-951. doi : 10.1038/nbt.2969

Yin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R. L., Benedetti, E., Grompe, M., … Anderson, D. G. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology, 32(6), 551-553. doi : 10.1038/nbt.2884

[3] Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M. et Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology, 169(12), 5429-5433.

[4] Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., … Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 315(5819), 1709-1712.

[5] Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A. et Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816-821. doi : 10.1126/science.1225829 

[6] Kim, Y. G., Cha, J. et Chandrasegaran, S. (1996). Hybrid restriction enzymes: Zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(3), 1156-1160.

[7] Boch, J., Scholze, H., Schornack, S., Landgraf, A., Hahn, S., Kay, S., … Bonas, U. (2009). Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science, 326(5959), 1509-1512. doi : 10.1126/science.1178811

[8] Résultats de la recherche du mot-clé « CRISPR » sur la banque de données PubMed : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=crispr

[9] Hammond, A., Galizi, R., Kyrou, K., Simoni, A., Siniscalchi, C., Katsanos, D., … Nolan, T. (2016). A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology, 34(1), 78-83. doi : 10.1038/nbt.3439

[10] Derks-Smeets, I. A., Gietel-Habets, J. J., Tibben, A., Tjan-Heijnen, V. C., Meijer-Hoogeveen, M., Geraedts, J. P., … van Osch, L. A. (2014). Decision-making on preimplantation genetic diagnosis and prenatal diagnosis: A challenge for couples with hereditary breast and ovarian cancer. Human Reproduction, 29(5), 1103-1112. doi : 10.1093/humrep/deu034

[11] Liang, P., Xu, Y., Zhang, X., Ding, C., Huang, R., Zhang, Z., … Huang, J. (2015). CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein & Cell, 6(5), 363-372. doi : 10.1007/s13238-015-0153-5

[12] Transcription de l’intervention de Jennifer Doudna devant le Sénat des États-Unis : https://science.house.gov/sites/republicans.science.house.gov/files/documents/HHRG-114-SY15-WState-JDoudna-20150616.pdf

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